МЕТОДИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К ДЕТЕКЦИИ ПРОЦЕССА АУТОФАГИИ В МЫШЕЧНЫХ КЛЕТКАХ

Введение. А утофагия — процесс, при котором компоненты клетки подвергаются деградации под действием лизосомальных ферментов, в результате чего формируется аутофагосома. В настоящее время процесс аутофагии рассматривается как одна из точек приложения ряда фармакологических подходов, в частности, при наследственной, орфанной патологии, а также при старении и сердечной недостаточности. Существенное значение для методической оценки процесса аутофагии имеет объект исследования и свойства изучаемой клеточной культуры. В данной работе проводился подбор оптимальных условий оценки процесса аутофагии в мышечных клетках мыши линии C2C12.

Методы. В работе проводился подбор условий для реализации таких методов оценки аутофагии, как проточная цитометрия, иммуноцитохимия и иммуноблотинг (Western Blot). Проводился поиск оптимальных условий пермеабилизации клеток различными детергентами, подбор температурных условий, времени фиксации материала и компонентов лизирующих растворов.

Результаты. Показано, что обязательным условием раздельной экстракции белка LC3 из растворимой и нерастворимой цитоплазматической фракции является применение детергента дигитонина в концентрации 0,025%. При проведении проточной цитометрии обязательными являются фиксация образцов и сокращенное время отмывки, позволяющее сохранить оптимальное количество клеток для анализа на фоне применения детергентов. Показано, что использование трансфекции клеток плазмидой, несущей LC3, приводит к увеличению необходимого времени сывороточной депривации.

Выводы. О птимизированные протоколы оценки процесса аутофагии при помощи детекции раздельных фракций белка LC3 в клетках мышечной линии С2С12 могут быть эффективно использованы при изучении фундаментальных молекулярных и клеточных механизмов развития миопатий и кардиомиопатий.

1. Elliott P, Andersson B, Arbustini E et al. Classification of the cardiomyopathies: a position statement from the European Society O f Cardiology Working Group on Myocardial and Pericardial Diseases. Eur Heart J. 2008; 29(2):270-276.

2. Vanderpluym C, Graham D, Almond C et al. Survival in patients removed from the heart transplant waiting list before receiving a transplant. J Heart Lung T ransplant. 2014; 33(3):261- 269.

3. Bhuiyan M, Pattison J, O sinska H et al. Enhanced autophagy ameliorates cardiac proteinopathy. J Clin Invest. 2013; 123(12):5284-5297.

4. De Palma C, Morisi F, Cheli S et al. Autophagy as a new therapeutic target in Duchenne muscular dystrophy. Cell Death Dis. 2012; 3:e418.

5. Jimenez R, Kubli D, Gustafsson A. Autophagy and Mitophagy in the Myocardium:Therapeutic Potential and Concerns. Br J Pharmacol. 2013; 171(8):1907-1916.

6. Kaminskyy V, Abdi A, Zhivotovsky B. A quantitative assay for the monitoring of autophagosome accumulation in different phases of the cell cycle. Autophagy. 2011; 7 (1):83–90.

7. Aits S, Jäättelä M, Nylandsted J. Methods for the quantification of lysosomal membrane permeabilization: a hallmark of lysosomal cell death. Methods Cell Biol.2015; 126:261–85.

8. Gottlieb R, Andres A, Sin J et al. U ntagling autophagy measurements. All Fluxed U p. Circ. Res.2015; 116:504–515.

9. Agholme L, Agnello M, Agostinis P et al. Guidlines for the use and interpretation of assas for monitoring autophagy. Autophagy. 2012; 8(4):445–544.

10. Puleston D, Phadwal K, Watson A et al. T echniques for the Detection of Autophagy in Primary Mammalian Cells. Cold Spring Harb. Protoc. 2015(9).