Исследование динамики активации Runx2 при индукции остеогенной дифференцировки

Актуальность. Несмотря на то, что Runx2 является общепризнанным маркером и регулятором остеогенной дифференцировки, механизмы его регуляции, динамика активации в ходе остеогенной дифференцировки и взаимосвязь с другими генами и генными путями, связанными с остеогенной дифференцировкой, остаются неясными.

Цель — проанализировать динамику активации Runx2 и влияние стабильного уровня белка на дифференцировочные процессы.

Материалы и методы. В работе были использованы лентивирусные конструкции генетических изоформ RUNX2: RUNX2full (полноразмерный ген), RUNX2delta (укороченная последовательность), RUNX2stop (со стоп-кодоном), также была использована шпилечная конструкция на RUNX2 — shRUNX2 для подавления его активности. Для поддержания стабильного уровня белка в клетках использовали ингибитор протеасомной деградации MG132. Для анализа динамики активации Runx2 остеогенную дифференцировку индуцировали на разные временные сроки. Анализ результатов проводился методом вестерн-блоттинга, ПЦР в реальном времени, окрашиванием ализариновым красным.

Результаты. Стабилизация белка Runx2 при 24 часах индукции остеогенной дифференцировки способствует ее усилению. Также уровень транскриптов Runx2 не изменяется, но происходит активация генов-мишеней.

Заключение. В процессе инициации остеогенной дифференцировки гингивальных фибробластов in vitro Runx2 регулируется как на транскрипционном, так и на посттранскрипционном уровнях; накопление небольшого уровня транскриптов при индукции остеогенной дифференцировки и стабилизация белка Runx2, по-видимому, являются критически важными.

1. Xu J, Li Z, Hou Y, Fang W. Potential mechanisms underlying the Runx2 induced osteogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells. Am J Transl Res. 2015 Dec 15;7(12):2527–2535. PMID: 26885254; PMCID: PMC4731654.

2. Rutkovskiy A, Stensløkken KO, Vaage IJ. Osteoblast Differentiation at a Glance. Med Sci Monit Basic Res. 2016 Sep 26;22:95–106. DOI: 10.12659/msmbr.901142.

3. Ferreira LB, Gimba E, Vinagre J, et al. Molecular Aspects of Thyroid Calcification. Int J Mol Sci. 2020 Oct 19;21(20):7718. DOI: 10.3390/ijms21207718.

4. Toth Z, Ward A, Tang SY, McBride-Gagyi S. Sexual differences in bone porosity, osteocyte density, and extracellular matrix organization due to osteoblastic-specific Bmp2 deficiency in mice. Bone. 2021 Sep;150:116002. DOI: 10.1016/j.bone.2021.116002.

5. Chen Y, Mehmood K, Chang YF, et al. The molecular mechanisms of glycosaminoglycan biosynthesis regulating chondrogenesis and endochondral ossification. Life Sci. 2023 Dec 15;335:122243. DOI: 10.1016/j.lfs.2023.122243.

6. Mevel R, Draper JE, Lie-A-Ling M, et al. RUNX transcription factors: orchestrators of development. Development. 2019 Sep 5;146(17):dev148296. DOI: 10.1242/dev.148296.

7. Lobov A, Kuchur P, Khizhina A, et al. Mesenchymal Cells Retain the Specificity of Embryonal Origin During Osteogenic Differentiation. Stem Cells. 2024 Jan 13;42(1):76–89. DOI: 10.1093/stmcls/sxad081.

8. Stein GS, Lian JB, van Wijnen AJ, et al. Runx2 control of organization, assembly and activity of the regulatory machinery for skeletal gene expression. Oncogene. 2004 May 24;23(24):4315–29. DOI: 10.1038/sj.onc.1207676.

9. Ducy P, Zhang R, Geoffroy V, et al. Osf2/Cbfa1: a transcriptional activator of osteoblast differentiation. Cell. 1997 May 30;89(5):747–54. DOI: 10.1016/s0092-8674(00)80257-3.

10. Bruderer M, Richards RG, Alini M, Stoddart MJ. Role and regulation of RUNX2 in osteogenesis. Eur Cell Mater. 2014 Oct 23;28:269–86. DOI: 10.22203/ecm.v028a19.

11. Sudhakar S, Katz MS, Elango N. Analysis of type-I and type-II RUNX2 protein expression in osteoblasts. Biochem Biophys Res Commun. 2001 Aug 10;286(1):74–79. DOI: 10.1006/bbrc.2001.5363.

12. Uyama M, Sato MM, Kawanami M, Tamura M. Regulation of osteoblastic differentiation by the proteasome inhibitor bortezomib. Genes Cells. 2012 Jul;17(7):548–58. DOI: 10.1111/j.1365-2443.2012.01611.x.