Громова Екатерина Сергеевна, старший лаборант-исследователь лаборатории регенеративной биомедицины
Тихорецкий пр., д. 4, Санкт-Петербург, 194064
Ekaterina S. Gromova, Senior Research Laboratory Assistant at the Laboratory of Regenerative Biomedicine
Tikhoretsky Prospekt, 4, Saint Petersburg, 194064
Азаркина Ксения Евгеньевна, старший лаборант-исследователь лаборатории регенеративной биомедицины
Санкт-Петербург
Ksenia E. Azarkina, Senior Research Laboratory Assistant at the Laboratory of Regenerative Biomedicine
Saint Petersburg
Костина Дарья Алексеевна, научный сотрудник лаборатории регенеративной биомедицины
Санкт-Петербург
Daria A. Kostina, Researcher at the Laboratory of Regenerative Biomedicine
Saint Petersburg
Переплетчикова Дарья Александровна, младший научный сотрудник лаборатории регенеративной биомедицины
Санкт-Петербург
Daria A. Perepletchikova, Junior Researcher at the Laboratory of Regenerative Biomedicine
Saint Petersburg
Смирнова Дарья Владимировна, младший научный сотрудник лаборатории регенеративной биомедицины
Санкт-Петербург
Darya V. Smirnova, Junior Researcher at the Laboratory of Regenerative Biomedicine
Saint Petersburg
Малашичева Анна Борисовна, д.б.н., заведующая лабораторией регенеративной биомедицины
Санкт-Петербург
Anna B. Malashicheva, Doctor of Biological Sciences, Head of the Laboratory of Regenerative Biomedicine
Saint Petersburg
Актуальность. Несмотря на то, что Runx2 является общепризнанным маркером и регулятором остеогенной дифференцировки, механизмы его регуляции, динамика активации в ходе остеогенной дифференцировки и взаимосвязь с другими генами и генными путями, связанными с остеогенной дифференцировкой, остаются неясными.
Цель — проанализировать динамику активации Runx2 и влияние стабильного уровня белка на дифференцировочные процессы.
Материалы и методы. В работе были использованы лентивирусные конструкции генетических изоформ RUNX2: RUNX2full (полноразмерный ген), RUNX2delta (укороченная последовательность), RUNX2stop (со стоп-кодоном), также была использована шпилечная конструкция на RUNX2 — shRUNX2 для подавления его активности. Для поддержания стабильного уровня белка в клетках использовали ингибитор протеасомной деградации MG132. Для анализа динамики активации Runx2 остеогенную дифференцировку индуцировали на разные временные сроки. Анализ результатов проводился методом вестерн-блоттинга, ПЦР в реальном времени, окрашиванием ализариновым красным.
Результаты. Стабилизация белка Runx2 при 24 часах индукции остеогенной дифференцировки способствует ее усилению. Также уровень транскриптов Runx2 не изменяется, но происходит активация генов-мишеней.
Заключение. В процессе инициации остеогенной дифференцировки гингивальных фибробластов in vitro Runx2 регулируется как на транскрипционном, так и на посттранскрипционном уровнях; накопление небольшого уровня транскриптов при индукции остеогенной дифференцировки и стабилизация белка Runx2, по-видимому, являются критически важными.
Background. Despite the fact that Runx2 is a generally recognized marker and regulator of osteogenic differentiation, the mechanisms of its regulation, the dynamics of activation during osteogenic differentiation and the relationship with other genes and gene pathways associated with osteogenic differentiation remain unclear.
The aim is to analyze the dynamics of Runx2 activation and the effect of stable protein levels on differentiation processes.
Materials and methods. Lentiviral constructs of RUNX2 genetic isoforms were used in the work: RUNX2full (full-size gene), RUNX2delta (shortened sequence), RUNX2stop (with stop codon), a hairpin design on RUNX2 — shRUNX2 was also used to suppress its activity. The proteasome degradation inhibitor MG132 was used to maintain stable protein levels in cells. To analyze the dynamics of Runx2 activation, osteogenic differentiation was induced for different time periods. The results were analyzed by Western blotting, real-time PCR, and alizarin red staining.
Results. Stabilization of the Runx2 protein at 24 hours of induction of osteogenic differentiation contributes to its strengthening. Also, the level of Runx2 transcripts does not change, but target genes are activated.
Conclusion. During the initiation of osteogenic differentiation of gingival fibroblasts in vitro, Runx2 is regulated at both the transcriptional and post-transcriptional levels; accumulation of a small level of transcripts during induction of osteogenic differentiation and stabilization of the Runx2 protein seem to be critically important.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.