Прямое сравнение вариантов дальне-красных флуоресцентных белков KATUSHKA с люциферазной биолюминесценцией на ксенографтных мышиных моделях изучения опухолей эпителиального происхождения

Актуальность. Исследования в области онкологии требуют использования животных ксенографтных моделей, соответствующих принципам гуманности и рациональности. Доклинические исследования низкомолекулярных ингибиторов, противоопухолевых моноклональных антител, вакцин, клеточных препаратов, в том числе CAR-T клеток, нуждаются в прижизненном контроле динамики роста опухоли. Широко применяемая люциферазная детекция биолюминесценции ксенографтов требует введения субстрата, однако инъекции менее гуманны, более трудоемки, дорогостоящи, стрессируют животное. Альтернативой люциферазной биолюминесценции могут быть флуоресцентные белки дальне-красного спектра, визуализация эмиссии которых в экспериментальных моделях in vivo упростит манипуляции с животными и увеличит доступность детекции.

Цель. Сравнить эффективность детекции динамики роста опухолевых ксенографтов in vivo в мышиных моделях с инъекцией опухоли шейки матки, применяя доступную линейку флуоресцентных дериватов красного белка одной клады Katushka с распространенной в in vivo исследованиях люциферазой Renilla.

Материалы и методы. Ксенографтные модели NSG-SGM3 мышей были получены подкожным введением модифицированных клеток линии HeLa, экспрессирующих флуоресцентные белки-репортеры Katushka, Katushka2S, TurboRFP, TurboFP650 и люциферазу Renilla. Исследование и оценку флуоресцентного и биолюминесцентного сигнала опухоли проводили на 7, 14, 21 сутки после введения ксенографта.

Результаты. Спектральные характеристики и детекция эмиссии белков-репортеров Katushka и Katushka2S выделяют данные маркеры среди всей линейки исследуемых белков дальне-красного спектра.

Заключение. Детекция флуоресцентного сигнала дальне-красных белков-репортеров Katushka и Katushka2S может служить полноценной альтернативой люциферазной биолюминесценции фермента Renilla в экспериментальных моделях in vivo в рамках иммунотерапевтических исследований.

1. Shaner NC, Campbell RE, Steinbach PA, et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol. 2004; 22(12):1567–1572. DOI: 10.1038/nbt1037.

2. Shaner NC, Patterson GH, Davidson MW. Advances in fluorescent protein technology. J Cell Sci. 2007; 120(Pt 24):4247–4260. DOI: 10.1242/jcs.005801.

3. Shaner NC, Lambert GG, Chammas A, et al. A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum. Nat Methods. 2013; 10(5):407– 409. DOI: 10.1038/nmeth.2413.

4. Shaner NC. Fluorescent proteins for quantitative microscopy: important properties and practical evaluation. Methods Cell Biol. 2014; 123:95–111. DOI: 10.1016/B978-012-420138-5.00006-9.

5. Swaminathan S. GFP: the green revolution. Nat Cell Biol. 2009; 11(S1):S20–S20. DOI: 10.1038/ncb1953.

6. Hastings JW. Biological diversity, chemical mechanisms, and the evolutionary origins of bioluminescent systems. J Mol Evol. 1983; 19(5):309–321. DOI: 10.1007/BF02101634.

7. Otto-Duessel M, Khankaldyyan V, GonzalezGomez I, et al. In vivo testing of Renilla luciferase substrate analogs in an orthotopic murine model of human glioblastoma. Mol Imaging. 2006; 5(2):57–64.

8. Filonov GS, Piatkevich KD, Ting LM, et al. Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging. Nat Biotechnol. 2011; 29(8):757–761. DOI: 10.1038/nbt.1918.

9. Shcherbakova DM, Verkhusha VV. Near-infrared fluorescent proteins for multicolor in vivo imaging. Nat Methods. 2013; 10(8):751–754. DOI: 10.1038/nmeth.2521.

10. Krumholz A, Shcherbakova DM, Xia J, et al. Multicontrast photoacoustic in vivo imaging using nearinfrared fluorescent proteins. Sci Rep. 2014; 4:3939. DOI: 10.1038/srep03939.

11. Leblond F, Davis SC, Valdés PA, et al. Pre-clinical whole-body fluorescence imaging: Review of instruments, methods and applications. J Photochem Photobiol B. 2010; 98(1):77–94. DOI: 10.1016/j.jphotobiol.2009.11.007.

12. Gurskaia NG, Staroverov DB, Fradkov AF, et al. Coding region of far-red fluorescent protein katushka contains a strong donor splice site. Bioorg Khim. 2011; 37(3):425–428. DOI: 10.1134/s1068162011030071.

13. Luker KE, Pata P, Shemiakina II, et al. Comparative study reveals better far-red fluorescent protein for whole body imaging. Sci Rep. 2015; 5:10332. DOI: 10.1038/srep10332.

14. Shcherbo D, Murphy CS, Ermakova GV, et al. Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues. Biochem J. 2009; 418(3):567–574. DOI: 10.1042/BJ20081949.

15. Shcherbo D, Shemiakina II, Ryabova AV, et al. Near-infrared fluorescent proteins. Nat Methods. 2010; 7(10):827–829. DOI: 10.1038/nmeth.1501.

16. FPbase: The Fluorescent Protein Database. https://www.fpbase.org/organism/6118/

17. The Jackson Laboratory. https://www.jax.org/strain/005557

18. Xia X, Li H, Satheesan S, Zhou J, et al. Humanized NOD/SCID/IL2rγnull (hu-NSG) Mouse Model for HIV Replication and Latency Studies. J Vis Exp. 2019; (143):10.3791/58255. DOI: 10.3791/58255.

19. Skoda J, Neradil J, Staniczkova Zambo I, et al. Serial Xenotransplantation in NSG Mice Promotes a Hybrid Epithelial/Mesenchymal Gene Expression Signature and Stemness in Rhabdomyosarcoma Cells. Cancers (Basel). 2020; 12(1):196. DOI: 10.3390/cancers12010196.

20. Jurczyk A, Diiorio P, Brostowin D, et al. Improved function and proliferation of adult human beta cells engrafted in diabetic immunodeficient NOD-scid IL2rγ(null) mice treated with alogliptin. Diabetes Metab Syndr Obes. 2013; 6:493–499. DOI: 10.2147/DMSO.S53154.

21. Wen H, Qu Z, Yan Y, et al. Preclinical safety evaluation of chimeric antigen receptor-modified T cells against CD19 in NSG mice. Ann Transl Med. 2019; 7(23):735. DOI: 10.21037/atm.2019.12.03.