Новая технология дозревания ооцитов человека методом инъекции внеклеточных везикул фолликулярной жидкости доноров под блестящую оболочку женской гаметы

Актуальность. В программах вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) не все ооциты, полученные при трансвагинальной пункции (ТВП), пригодны для оплодотворения, так как не все находятся на стадии МII. Ооциты на стадиях герминативного везикула (GV) и MI обычно утилизируются, поскольку после удаления кумулюсных клеток (КК) их дозревание и оплодотворение невозможны. В данном исследовании предложен метод дозревания таких ооцитов с помощью введения внеклеточных везикул (ВВ) фолликулярной жидкости (ФЖ) в перивителлиновое пространство. Цель. Оценить клиническую состоятельность технологии дозревания незрелых ооцитов без клеток кумулюса (стадии GV и MI) путем инъекции ВВ ФЖ донора под блестящую оболочку клетки. Материалы и методы. Собрано по 5 мл ФЖ от 4 доноров. Выделение ВВ ФЖ проводили методом последовательного центрифугирования. Часть везикул проанализировали с помощью метода анализа траекторий наночастиц (Nanoparticle Tracking Analysis, NTA), другую часть изучали с помощью трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ). Отобрали 53 незрелых ооцита в основную группу и 18 в группу контроля. Инъекцию ВВ ФЖ до нора проводили через 4 часа после удаления КК, вводя под блестящую оболочку суспензию ВВ. Через 17 часов оценивали зрелость ооцитов в обеих группах. Результаты. Частота дозревания ооцитов в группе основной была статистически значимо выше, чем в группе сравнения, что свидетельствует о потенциальной эффективности метода EV-IVM для дозревания ооцитов на стадии GV. Заключение. Полученные данные дают надежду на разработку нового метода дозревания ооцитов в условиях in vitro.

1. Silber SJ, Goldsmith S, Castleman L, Hayashi K. In Vitro Maturation, In Vitro Oogenesis, and Ovarian Longevity. Reprod Sci. 2024 May;31(5):1234–1245. DOI: 10.1007/s43032-023-01427-1. Epub 2023 Dec 30. PMID: 38160209; PMCID: PMC11090930.

2. Das M, Son WY. In vitro maturation (IVM) of human immature oocytes: is it still relevant? Reprod Biol Endocrinol. 2023 Nov 22;21(1):110. DOI: 10.1186/s12958023-01162-x. PMID: 37993914; PMCID: PMC10664544.

3. Ho VN, Ho TM, Vuong LN, García-Velasco J. An update on the current indications for in vitro maturation. Curr Opin Obstet Gynecol. 2024 Jun 1;36(3):173–180. DOI: 10.1097/GCO.0000000000000942. Epub 2024 Jan 31. PMID: 38295060.

4. Nejabati HR, Roshangar L, Nouri M. Follicular f luid extracellular vesicle miRNAs and ovarian aging. Clin Chim Acta. 2023 Jan 1;538:29–35. DOI: 10.1016/j.cca.2022.11.003. Epub 2022 Nov 8. PMID: 36368351.

5. Zhou Z, Zhang Y, Zhang X, et al. Follicular Fluid-Derived Small Extracellular Vesicles Alleviate DHEA-Induced Granulosa Cell Apoptosis by Delivering LINC00092. Reprod Sci. 2023 Oct;30(10):3092–3102. DOI: 10.1007/s43032-023-01251-7. Epub 2023 May 15. PMID: 37188981.

6. Sysoeva AP, Makarova NP, Silachev DN, et al. Influence of Extracellular Vesicles of the Follicular Fluid on Morphofunctional Characteristics of Human Sperm. Bull Exp Biol Med. 2021 Dec;172(2):254–262. DOI: 10.1007/s10517-021-05372-4. Epub 2021 Dec 2. PMID: 34855079.

7. Neyroud AS, Chiechio RM, Moulin G, et al. Diversity of Extracellular Vesicles in Human Follicular Fluid: Morphological Analysis and Quantification. Int J Mol Sci. 2022 Oct 2;23(19):11676. DOI: 10.3390/ijms231911676. PMID: 36232981; PMCID: PMC9570429.

8. Gabryś J, Kij-Mitka B, Sawicki S, et al. Extracellular vesicles from follicular fluid may improve the nuclear maturation rate of in vitro matured mare oocytes. Theriogenology. 2022 Aug;188:116–124. DOI: 10.1016/j.theriogenology.2022.05.022. Epub 2022 May 27. PMID: 35689941.

9. Патент № 2807492 C1 Российская Федерация, МПК C12N 5/075, A61K 35/54. Технология дозревания ооцитов человека на стадии GV с помощью внеклеточных везикул фолликулярной жидкости в про граммах экстракорпорального оплодотворения: EV-IVM (extracellular vesicles in vitro maturation): № 2023101793: заявл. 27.01.2023: опубл. 15.11.2023 / Н. П. Макарова, А. П. Сысоева, Д. Н. Силачев [и др.]; заявитель Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В. И. Кулакова» Министерства здравоохранения Российской Федерации. EDN WEZOFP].

10. Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 31.07.2020 № 803н «О порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий, противопоказаниях и ограничениях к их применению» (зарегистрирован 19.10.2020 № 60457). Текст: электронный // Официальный интернет-портал правовой информации: – URL: http://publication.pravo.gov.ru/Document/View/0001202010190041?.

11. Клинические рекомендации. Женское бесплодие. 2024. Текст: электронный // Министерство здравоохранения Российской Федерации: официальный сайт. – URL: https://mosgorzdrav.ru/ru-RU/magic/default/download/14971.html (дата обращения: 01.12.2024).

12. Welsh JA, Goberdhan DCI, et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): From basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 2024 Feb;13(2):e12404. DOI: 10.1002/jev2.12404. Erratum in: J Extracell Vesicles. 2024 May;13(5):e12451. DOI: 10.1002/jev2.12451. PMID: 38326288; PMCID: PMC10850029.

13. Kenigsberg S, Wyse BA, Librach CL, da Silveira JC. Protocol for exosome isolation from small volume of ovarian follicular fluid: evaluation of ultracentrifugation and commercial kits // Methods Mol. Biol. 2017. Vol. 1660. P. 321–341. DOI: 10.1007/978-1-4939-7253-1_26.

14. Zorova LD, Kovalchuk SI, Popkov VA, et al. Do Extracellular Vesicles Derived from Mesenchymal Stem Cells Contain Functional Mitochondria? Int J Mol Sci. 2022 Jul 3;23(13):7408. DOI: 10.3390/ijms23137408. PMID: 35806411; PMCID: PMC9266972.

15. Martinez CA, Rizos D, Rodriguez-Martinez H, Funahashi H. Oocyte-cumulus cells crosstalk: New comparative insights. Theriogenology. 2023 Jul 15;205:87 93. DOI: 10.1016/j.theriogenology.2023.04.009. Epub 2023 Apr 18. PMID: 37105091.

16. Nagyova E. The Biological Role of Hyaluronan Rich Oocyte-Cumulus Extracellular Matrix in Female Reproduction. Int J Mol Sci. 2018 Jan 18;19(1):283. DOI: 10.3390/ijms19010283. PMID: 29346283; PMCID: PMC5796229.

17. Del Bianco D, Gentile R, Sallicandro L, et al. Electro-Metabolic Coupling of Cumulus-Oocyte Complex. Int J Mol Sci. 2024 May 14;25(10):5349. DOI: 10.3390/ijms25105349. PMID: 38791387; PMCID: PMC11120766.

18. Machtinger R, Racowsky C, Baccarelli AA, et al. Recombinant human chorionic gonadotropin and gonadotropin-releasing hormone agonist differently affect the profile of extracellular vesicle microRNAs in human follicular fluid. J Assist Reprod Genet. 2023;40:527–536. https://doi.org/10.1007/s10815-022-02703-w

19. Piibor J, Dissanayake K, Midekessa G, et al. Characterization of bovine uterine fluid extracellular vesicles proteomic profiles at follicular and luteal phases of the oestrous cycle. Vet Res Commun. 2023;47:885–900. https://doi.org/10.1007/s11259-022-10052-3

20. Aoki S, Inoue Y, Hara S, et al. microRNAs associated with the quality of follicular fluids affect oocyte and early embryonic development. Reprod Med Biol. 2024 Jan 18;23(1):e12559. DOI: 10.1002/rmb2.12559. PMID: 38239486; PMCID: PMC10795439.

21. Luis-Calero M, Marinaro F, et al. Characterization of preovulatory follicular fluid secretome and its effects on equine oocytes during in vitro maturation. Res Vet Sci. 2024 May;171:105222. DOI: 10.1016/j.rvsc.2024.105222. Epub 2024 Mar 11. PMID: 38513461.

22. Nicolao MC, Rodriguez Rodrigues C, Cumino AC. Extracellular vesicles from Echinococcus granulosus larval stage: Isolation, characterization and uptake by dendritic cells. PLoS Negl Trop Dis. 2019;13(1):e0007032. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0007032