Гепариназа устраняет гепарин-ассоциированное ингибирование полимеразной цепной реакции в реальном времени при оценке экспрессии генов в тканях легких

   Актуальность. При изучении патологий часто используют гистологические и молекулярно-генетические методы исследования. Для предотвращения загрязнения элементами крови гистологических препаратов проводят перфузию микроциркуляторного русла раствором гепарина, что ведет к его накоплению в ткани образца. Известно, что гепарин является ингибитором полимеразной цепной реакции (ПЦР) за счет блокирования сайтов связывания ДНК-полимеразы с ДНК-мишенью.

   Цель. Изучить возможность предотвращения влияния нефракционированного гепарина (НФГ), используемого при перфузии органов, на результат оценки уровня экспрессии генов в образцах легких крыс методом ОТ-ПЦР за счет предварительной обработки гепариназой препаратов РНК.

   Материалы и методы. Перфузию сосудистого русла крыс проводили НФГ в концентрациях 50 МЕ/мл (n = 3) и 500 МЕ/мл (n = 3) либо раствором хлорида натрия (n = 3) в качестве контроля. Тотальную РНК выделяли из образцов левого легкого крыс, после чего обрабатывали гепариназой. Оценку уровня относительной экспрессии пяти генов: s18, HPRT, Actinβ, GAPDH, Vim до и после обработки гепариназой препаратов выделенной РНК проводили на основе абсолютного значения порогового цикла (Ct), полученного методом ОТ-ПЦР.

   Результаты. Данные показали, что НФГ повышает уровень порогового цикла в ОТ-ПЦР. Обработка образцов гепариназой не оказывает воздействие на количество и качество РНК, при этом статистически значимо снижает уровень порогового цикла по сравнению с необработанными гепариназой образцами.

   Заключение. При планировании исследования необходимо учитывать искажения результатов генетического исследования, возникающие из-за перфузии органа раствором гепарина. Использование гепариназы эффективно устраняет гепарин-ассоциированное ингибирование ОТ-ПЦР, не влияя на качество и количество исходной РНК.

1. Mullis KB. The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction. Sci Am. 1990; 262(4):56–65. DOI: 10.1038/scientificamerican0490-56.

2. Schrader C, Schielke A, Ellerbroek L, et al. PCR inhibitors - occurrence, properties and removal. J Appl Microbiol. 2012; 113(5):1014–26. DOI: 10.1111/j.1365-2672.2012.05384.x.

3. Oduah EI, Linhardt RJ, Sharfstein ST. Heparin: Past, Present, and Future. Pharmaceuticals. 2016; 9(3):38. DOI: 10.3390/ph9030038.

4. Yokota M, Tatsumi N, Nathalang O, et al. Effects of heparin on polymerase chain reaction for blood white cells. J Clin Lab Anal. 1999; 13(3):133–40. DOI: 10.1002/(sici)1098-2825(1999)13:3<133::aid-jcla8>3.0.co;2-0.

5. Satsangi J, Jewell DP, Welsh K, et al. Effect of heparin on polymerase chain reaction. The Lancet. 1994; 343(8911):1509–10. DOI: 10.1016/s0140-6736(94)92622-0.

6. Al-Soud WA, Rådström P. Purification and Characterization of PCR-Inhibitory Components in Blood Cells. J Clin Microbiol. 2001; 39(2):485–93. DOI: 10.1128/JCM.39.2.485-493.2001.

7. Vaughan-Shaw PG, Walker M, Ooi L, et al. A simple method to overcome the inhibitory effect of heparin on DNA amplification. Cell Oncol. 2015; 38(6):493–5. DOI: 10.1007/s13402-015-0250-8.

8. Coelho-Lima J, Mohammed A, Cormack S, et al. Overcoming Heparin-Associated RT-qPCR Inhibition and Normalization Issues for microRNA Quantification in Patients with Acute Myocardial Infarction. Thromb Haemost. 2018; 118(07):1257–69. DOI: 10.1055/s-0038-1660437.

9. Bai X hui, Fischer S, Keshavjee S, et al. Heparin interference with reverse transcriptase polymerase chain reaction of RNA extracted from lungs after ischemia-reperfusion. Transpl Int. 2000; 13(2):146–50. DOI: 10.1007/s001470050306.

10. Jung R, Lübcke C, Wagener C, et al. Reversal of RT-PCR Inhibition Observed in Heparinized Clinical Specimens. BioTechniques. 1997; 23(1):24–8. DOI: 10.2144/97231bm03.

11. Kermekchiev MB, Kirilova LI, Vail EE, et al. Mutants of Taq DNA polymerase resistant to PCR inhibitors allow DNA amplification from whole blood and crude soil samples. Nucleic Acids Res. 2009; 37(5):e40–e40. DOI: 10.1093/nar/gkn1055.

12. Izreli S, Pfleiderer C, Lion T. Detection of gene expression by PCR amplification of RNA derived from frozen heparinized whole blood. Nucleic Acids Res. 1991; 19(21):6051–6051. DOI: 10.1093/nar/19.21.6051.

13. Davenport ML, Sherrill TP, Blackwell TS, et al. Perfusion and Inflation of the Mouse Lung for Tumor Histology. J Vis Exp. 2020; (162):10.3791/60605. DOI: 10.3791/60605.

14. Steffes LC, Kumar ME. Chronic Daily House Dust Mite Exposure in Mice is an Effective Model to Quantify the Effect of Pharmacologic Agents on Discrete Stages of Artery Remodeling in Pulmonary Hypertension. Bio Protoc. 2022; 12(1):e4273. DOI: 10.21769/BioProtoc.4273.

15. Karpov AA, Vachrushev NS, Shilenko LA, et al. Sympathetic Denervation and Pharmacological Stimulation of Parasympathetic Nervous System Prevent Pulmonary Vascular Bed Remodeling in Rat Model of Chronic Thromboembolic Pulmonary Hypertension. J Cardiovasc Dev Dis. 2023; 10(2):40. DOI: 10.3390/jcdd10020040.

16. Kondratov K, Kurapeev D, Popov M, et al. Heparinase treatment of heparin-contaminated plasma from coronary artery bypass grafting patients enables reliable quantification of microRNAs. Biomol Detect Quantif. 2016; 8:9–14. DOI: 10.1016/j.bdq.2016.03.001.

17. Gao P, Li C, Ning Y, et al. Improvement of surgical techniques for orthotopic single lung transplantation in rats. Ann Transl Med. 2022; 10(12):673. DOI: 10.21037/atm-22-2018.

18. Lee LYY, Suryadinata R, McCafferty C, et al. Heparin Inhibits SARS-CoV-2 Replication in Human Nasal Epithelial Cells. Viruses. 2022 24; 14(12):2620. DOI: 10.3390/v14122620.

19. Alinezhad P, Staji H, Sani RN. Comparison of three methods including temperature, H₂O₂/ascorbic acid/sonication, and nitrous acid treatments for overcoming the inhibitory effect of heparin on DNA amplification in realtime-PCR. Int J Biol Macromol. 2022; 209:1298–1306. DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2022.04.113.

20. Sidstedt M, Rådström P, Hedman J. PCR inhibition in qPCR, dPCR and MPS-mechanisms and solutions. Anal Bioanal Chem. 2020; 412(9):2009–2023. DOI: 10.1007/s00216-020-02490-2