Адаптация методики определения изменения митохондриального мембранного потенциала в клетках C2C12 с использованием готового набора «Mitochondrial Membrane Potential Kit» (Sigma-Aldrich)

   В статье представлены результаты адаптации методики определения изменений митохондриального мембранного потенциала (MMP) в клетках С2С12 с использованием готового набора «Mitochondrial membrane Potential Kit» производства Sigma-Aldrich (каталожный номер MAK159) для исследования на микропланшетном ридере и флуоресцентном микроскопе. Подобраны условия для проведения измерения, необходимые разведения для получения оптимальной концентрации для измерения MMP в клетках мышиных миобластов С2С12. Проведено сравнение правильности выполнения исследования с использованием флуоресцентного красителя TMRE (этилового эфира тетраметилродамина).

   Актуальность. При использовании готового набора «Mitochondrial membrane Potential Kit» (Sigma-Aldrich) мы столкнулись с тем, что в руководстве пользователя производитель не указывает концентрацию JC-10 и дает лишь общие рекомендации по использованию красителя, не учитывающие тип клеток, размер, плотность, разницу во времени инкубации для различных культур клеток.

   Цель работы. Адаптировать методику определения МMП (митохондриальный мембранный потенциал) в клетках С2С12 с использованием набора для исследования на микропланшетном ридере и электронном микроскопе.

   Материалы и методы. ММП в клетках С2С12 измерялся двумя методами: с помощью флуоресцентной микроскопии (Zeiss, программа Zen) и с использованием планшетного флуориметра (CLARIOstar (BMG LABTECH). В качестве флуоресцентных зондов использовались красители JC-10, TMRE (Sigma-Aldrich).

   Результаты. Были подобраны оптимальные условия для регистрации изменения митохондриального мембранного потенциала в клетках С2С12. Достоверные и воспроизводимые результаты были получены при 100-кратном разведении раствора красителя для загрузки JC-10 (Dye Loading Solution) и замене стандартного буфера производителя на стандартный натрий-фосфатный буфер (рН = 7,4).

   Заключение. При использовании готовых наборов для измерения ММП методика, предложенная производителем, может не подходить для выбранной клеточной линии. В нашем случае при исследовании мышиных миобластов линии С2С12 оптимальным оказалось разведение красителя для загрузки в 100 раз по сравнению с рекомендованным производителем.

1. Zorova LD, Popkov VA, Plotnikov EJ, et al. Functional Significance of the Mitochondrial Membrane Potential. Biochem. Moscow Suppl. Ser. A. 2018; (12): 20–26. DOI: 10.1134/S1990747818010129.

2. Perry SW, Norman JP, Barbieri J, et al. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. Biotechniques. 2011;50(2):98–115. DOI: 10.2144/000113610.

3. Mathur A, Hong Y, Kemp BK, et al. Evaluation of fluorescent dyes for the detection of mitochondrial membrane potential changes in cultured cardiomyocytes. Cardiovasc Res. 2000;46(1):126–38. DOI: 10.1016/s0008-6363(00)00002-x.

4. Buckman JF, Reynolds IJ. Spontaneous changes in mitochondrial membrane potential in cultured neurons. J Neurosci. 2001;21(14):5054–65. DOI: 10.1523/JNEUROSCI.21-14-05054.2001.