transmedТрансляционная медицинаTranslational Medicine2311-44952410-5155Almazov National Medical Research Centre, Saint Petersburg, Russia10.18705/2311-4495-2024-11-1-55-64CFKQDBtransmed-903Research ArticleМОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ И ГЕНЕТИКАГепариназа устраняет гепарин-ассоциированное ингибирование полимеразной цепной реакции в реальном времени при оценке экспрессии генов в тканях легкихHeparinase eliminates heparin-associated inhibition of the real-time polymerase chain reaction when assessing gene expression in lung tissueВахрушевН. С.VaсhrushevN. S.

Никита Сергеевич Вахрушев, аспирант

кафедра клеточной биологии

197341; ул. Аккуратова, д. 2; Санкт-Петербург

Nikita S. Vaсhrushev, PhD student

Department of Cellular Biology

197341; Akkuratova str., 2; Saint Petersburg

drabrikos@gmail.comШиленкоЛ. А.ShilenkoL. A.

Леонид Алексеевич Шиленко, ординатор 1 года, лаборант-исследователь 

кафедра факультетской терапии с клиникой; НИЛ патологии малого круга кровообращения

Санкт-Петербург

Leonid A. Shilenko,  first-year resident, Laboratory Assistant

Department of Faculty Therapy with a clinic; Laboratory of Pulmonary Vascular Disease

Saint Petersburg

ЧерваевА. А.ChervaevAl-Kh. A.

Аль-Халим Амирович Черваев, ординатор 1 года

кафедра нейрохирургии

Санкт-Петербург

Al-Khalim A. Chervaev, first-year resident

Department of Neurosurgery

Saint Petersburg

КарповА. А.KarpovA. A.

Андрей Александрович Карпов,  к. м. н., заведующийНИЛ, доцент, ведущий научный сотрудник

НИЛ патологии малого круга кровообращения;  Институт медицинского образования; кафедра патологии; отдел «Технологии сильного искусственного интеллекта в физиологии и медицине»

Санкт-Петербург

Andrei A. Karpov, PhD, Head of Laboratory, Associate Professor; Leading Researcher

Laboratory of Pulmonary Vascular Disease; Department of Pathology; Department of “Strong Artificial Intelligence Technologies in Physiology and Medicine”

Saint Petersburg

a--karpoff@mail.ruГалагудзаМ. М.GalagudzaM. M.

Михаил Михайлович Галагудза, д. м. н., профессор, член-корреспондент РАН, директор Института, заведующий кафедрой

Институт экспериментальной медицины; Институт медицинского образования; кафедра патологии

Санкт-Петербург

Michael M. Galagudza, MD, DSc, Professor, Corresponding Member of the Russian Academy of Science, Director of Institute, Head of the Department

Institute of Experimental Medicine; Department of Pathology

Saint Petersburg

КостареваА. А.KostarevaA. A.

Анна Александровна Костарева, д. м. н., директорИнститута

Институт молекулярной биологии и генетики

Санкт-Петербург

Anna A. Kostareva, DSc in Medicine, Director of the Institute

Institute of Molecular Biology and Genetics

Saint Petersburg

https://orcid.org/0000-0001-8567-0879КалининаО. В.KalininaO. V.

Ольга Викторовна Калинина, д. б. н., профессор

кафедра лабораторной медицины и генетики

Санкт-Петербург

Olga V. Kalinina, DSc in Biology, Professor

Department of Laboratory Medicine and Genetics

Saint Petersburg

olgakalinina@mail.ruФедеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр имени В. А. Алмазова» Министерства здравоохранения Российской ФедерацииРоссияAlmazov National Medical Research CentreRussian FederationФедеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр имени В. А. Алмазова» Министерства здравоохранения Российской Федерации; Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Санкт-Петербургский государственный электротехнический университет «ЛЭТИ» имени В. И. Ульянова (Ленина)»РоссияAlmazov National Medical Research Centre; Saint Petersburg Electrotechnical University “LETI”Russian FederationФедеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр имени В. А. Алмазова» Министерства здравоохранения Российской ФедерацииРоссияAlmazov National Medical Research Centre; Saint-Petersburg Pasteur InstituteRussian FederationФедеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр имени В. А. Алмазова» Министерства здравоохранения Российской Федерации; Федеральное бюджетное учреждение науки «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человекаРоссияAlmazov National Medical Research CentreRussian Federation2024150420241115564Copyright © Вахрушев Н.С., Шиленко Л.А., Черваев А.А., Карпов А.А., Галагудза М.М., Костарева А.А., Калинина О.В., 20242024Вахрушев Н.С., Шиленко Л.А., Черваев А.А., Карпов А.А., Галагудза М.М., Костарева А.А., Калинина О.В.Vaсhrushev N.S., Shilenko L.A., Chervaev A.A., Karpov A.A., Galagudza M.M., Kostareva A.A., Kalinina O.V.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://transmed.almazovcentre.ru/jour/article/view/903   Актуальность

   Актуальность. При изучении патологий часто используют гистологические и молекулярно-генетические методы исследования. Для предотвращения загрязнения элементами крови гистологических препаратов проводят перфузию микроциркуляторного русла раствором гепарина, что ведет к его накоплению в ткани образца. Известно, что гепарин является ингибитором полимеразной цепной реакции (ПЦР) за счет блокирования сайтов связывания ДНК-полимеразы с ДНК-мишенью.

   Цель

   Цель. Изучить возможность предотвращения влияния нефракционированного гепарина (НФГ), используемого при перфузии органов, на результат оценки уровня экспрессии генов в образцах легких крыс методом ОТ-ПЦР за счет предварительной обработки гепариназой препаратов РНК.

   Материалы и методы

   Материалы и методы. Перфузию сосудистого русла крыс проводили НФГ в концентрациях 50 МЕ/мл (n = 3) и 500 МЕ/мл (n = 3) либо раствором хлорида натрия (n = 3) в качестве контроля. Тотальную РНК выделяли из образцов левого легкого крыс, после чего обрабатывали гепариназой. Оценку уровня относительной экспрессии пяти генов: s18, HPRT, Actinβ, GAPDH, Vim до и после обработки гепариназой препаратов выделенной РНК проводили на основе абсолютного значения порогового цикла (Ct), полученного методом ОТ-ПЦР.

   Результаты

   Результаты. Данные показали, что НФГ повышает уровень порогового цикла в ОТ-ПЦР. Обработка образцов гепариназой не оказывает воздействие на количество и качество РНК, при этом статистически значимо снижает уровень порогового цикла по сравнению с необработанными гепариназой образцами.

   Заключение

   Заключение. При планировании исследования необходимо учитывать искажения результатов генетического исследования, возникающие из-за перфузии органа раствором гепарина. Использование гепариназы эффективно устраняет гепарин-ассоциированное ингибирование ОТ-ПЦР, не влияя на качество и количество исходной РНК.

   Background. Histological and genetic methods are often used in the study of pathologies. To prevent contamination of histological preparations with blood, the microvasculature is perfused with a heparin, which leads to its accumulation in the tissue. Heparin is an inhibitor of the polymerase chain reaction (PCR).   Objective. To study the possibility of preventing the influence of unfractionated heparin (UFH), used in perfusion, on the result of gene expression in rat lung samples using RT-PCR by pretreatment RNA with heparinase.   Design and methods. Perfusion of the rats’ vasculature was performed with UFH at concentrations of 50 IU/mL (n = 3) and 500 IU/mL (n = 3), or with a sodium chloride (n = 3) as a control. RNA was isolated from left lung samples and treated with heparinase. The relative expression of five genes (s18, HPRT, Actinβ, GAPDH, Vim) before and after heparinase treatment of isolated RNA preparations was assessed based on the absolute value of the threshold cycle (Ct) obtained by RT-PCR.   Results. UFH increases the threshold cycle level. Treatment of samples with heparinase does not affect the quantity and quality of RNA, but reduce the Ct compared to samples not treated with heparinase.   Conclusion. While planning a study, it is necessary to consider alterations in the results of genetic research that arise due to organ perfusion with a heparin solution. The use of heparinase effectively eliminates heparin-associated RT-PCR inhibition.

гепаринОТ-ПЦРперфузия тканейРНКheparinRNART-PCRtissue perfusionИсследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 23-75-10122, https://rscf.ru/project/23-75-10122The research was carried out at the expense of a grant from the Russian Science Foundation No. 23-75-10122, https://rscf.ru/ project/23-75-10122ReferencesMullis KB. The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction. Sci Am. 1990; 262(4):56–65. DOI: 10.1038/scientificamerican0490-56.Mullis KB. The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction. Sci Am. 1990; 262(4):56–65. DOI: 10.1038/scientificamerican0490-56.Schrader C, Schielke A, Ellerbroek L, et al. PCR inhibitors - occurrence, properties and removal. J Appl Microbiol. 2012; 113(5):1014–26. DOI: 10.1111/j.1365-2672.2012.05384.x.Schrader C, Schielke A, Ellerbroek L, et al. PCR inhibitors - occurrence, properties and removal. J Appl Microbiol. 2012; 113(5):1014–26. DOI: 10.1111/j.1365-2672.2012.05384.x.Oduah EI, Linhardt RJ, Sharfstein ST. Heparin: Past, Present, and Future. Pharmaceuticals. 2016; 9(3):38. DOI: 10.3390/ph9030038.Oduah EI, Linhardt RJ, Sharfstein ST. Heparin: Past, Present, and Future. Pharmaceuticals. 2016; 9(3):38. DOI: 10.3390/ph9030038.Yokota M, Tatsumi N, Nathalang O, et al. Effects of heparin on polymerase chain reaction for blood white cells. J Clin Lab Anal. 1999; 13(3):133–40. DOI: 10.1002/(sici)1098-2825(1999)13:3<133::aid-jcla8>3.0.co;2-0.Yokota M, Tatsumi N, Nathalang O, et al. Effects of heparin on polymerase chain reaction for blood white cells. J Clin Lab Anal. 1999; 13(3):133–40. DOI: 10.1002/(sici)1098-2825(1999)13:3<133::aid-jcla8>3.0.co;2-0.Satsangi J, Jewell DP, Welsh K, et al. Effect of heparin on polymerase chain reaction. The Lancet. 1994; 343(8911):1509–10. DOI: 10.1016/s0140-6736(94)92622-0.Satsangi J, Jewell DP, Welsh K, et al. Effect of heparin on polymerase chain reaction. The Lancet. 1994; 343(8911):1509–10. DOI: 10.1016/s0140-6736(94)92622-0.Al-Soud WA, Rådström P. Purification and Characterization of PCR-Inhibitory Components in Blood Cells. J Clin Microbiol. 2001; 39(2):485–93. DOI: 10.1128/JCM.39.2.485-493.2001.Al-Soud WA, Rådström P. Purification and Characterization of PCR-Inhibitory Components in Blood Cells. J Clin Microbiol. 2001; 39(2):485–93. DOI: 10.1128/JCM.39.2.485-493.2001.Vaughan-Shaw PG, Walker M, Ooi L, et al. A simple method to overcome the inhibitory effect of heparin on DNA amplification. Cell Oncol. 2015; 38(6):493–5. DOI: 10.1007/s13402-015-0250-8.Vaughan-Shaw PG, Walker M, Ooi L, et al. A simple method to overcome the inhibitory effect of heparin on DNA amplification. Cell Oncol. 2015; 38(6):493–5. DOI: 10.1007/s13402-015-0250-8.Coelho-Lima J, Mohammed A, Cormack S, et al. Overcoming Heparin-Associated RT-qPCR Inhibition and Normalization Issues for microRNA Quantification in Patients with Acute Myocardial Infarction. Thromb Haemost. 2018; 118(07):1257–69. DOI: 10.1055/s-0038-1660437.Coelho-Lima J, Mohammed A, Cormack S, et al. Overcoming Heparin-Associated RT-qPCR Inhibition and Normalization Issues for microRNA Quantification in Patients with Acute Myocardial Infarction. Thromb Haemost. 2018; 118(07):1257–69. DOI: 10.1055/s-0038-1660437.Bai X hui, Fischer S, Keshavjee S, et al. Heparin interference with reverse transcriptase polymerase chain reaction of RNA extracted from lungs after ischemia-reperfusion. Transpl Int. 2000; 13(2):146–50. DOI: 10.1007/s001470050306.Bai X hui, Fischer S, Keshavjee S, et al. Heparin interference with reverse transcriptase polymerase chain reaction of RNA extracted from lungs after ischemia-reperfusion. Transpl Int. 2000; 13(2):146–50. DOI: 10.1007/s001470050306.Jung R, Lübcke C, Wagener C, et al. Reversal of RT-PCR Inhibition Observed in Heparinized Clinical Specimens. BioTechniques. 1997; 23(1):24–8. DOI: 10.2144/97231bm03.Jung R, Lübcke C, Wagener C, et al. Reversal of RT-PCR Inhibition Observed in Heparinized Clinical Specimens. BioTechniques. 1997; 23(1):24–8. DOI: 10.2144/97231bm03.Kermekchiev MB, Kirilova LI, Vail EE, et al. Mutants of Taq DNA polymerase resistant to PCR inhibitors allow DNA amplification from whole blood and crude soil samples. Nucleic Acids Res. 2009; 37(5):e40–e40. DOI: 10.1093/nar/gkn1055.Kermekchiev MB, Kirilova LI, Vail EE, et al. Mutants of Taq DNA polymerase resistant to PCR inhibitors allow DNA amplification from whole blood and crude soil samples. Nucleic Acids Res. 2009; 37(5):e40–e40. DOI: 10.1093/nar/gkn1055.Izreli S, Pfleiderer C, Lion T. Detection of gene expression by PCR amplification of RNA derived from frozen heparinized whole blood. Nucleic Acids Res. 1991; 19(21):6051–6051. DOI: 10.1093/nar/19.21.6051.Izreli S, Pfleiderer C, Lion T. Detection of gene expression by PCR amplification of RNA derived from frozen heparinized whole blood. Nucleic Acids Res. 1991; 19(21):6051–6051. DOI: 10.1093/nar/19.21.6051.Davenport ML, Sherrill TP, Blackwell TS, et al. Perfusion and Inflation of the Mouse Lung for Tumor Histology. J Vis Exp. 2020; (162):10.3791/60605. DOI: 10.3791/60605.Davenport ML, Sherrill TP, Blackwell TS, et al. Perfusion and Inflation of the Mouse Lung for Tumor Histology. J Vis Exp. 2020; (162):10.3791/60605. DOI: 10.3791/60605.Steffes LC, Kumar ME. Chronic Daily House Dust Mite Exposure in Mice is an Effective Model to Quantify the Effect of Pharmacologic Agents on Discrete Stages of Artery Remodeling in Pulmonary Hypertension. Bio Protoc. 2022; 12(1):e4273. DOI: 10.21769/BioProtoc.4273.Steffes LC, Kumar ME. Chronic Daily House Dust Mite Exposure in Mice is an Effective Model to Quantify the Effect of Pharmacologic Agents on Discrete Stages of Artery Remodeling in Pulmonary Hypertension. Bio Protoc. 2022; 12(1):e4273. DOI: 10.21769/BioProtoc.4273.Karpov AA, Vachrushev NS, Shilenko LA, et al. Sympathetic Denervation and Pharmacological Stimulation of Parasympathetic Nervous System Prevent Pulmonary Vascular Bed Remodeling in Rat Model of Chronic Thromboembolic Pulmonary Hypertension. J Cardiovasc Dev Dis. 2023; 10(2):40. DOI: 10.3390/jcdd10020040.Karpov AA, Vachrushev NS, Shilenko LA, et al. Sympathetic Denervation and Pharmacological Stimulation of Parasympathetic Nervous System Prevent Pulmonary Vascular Bed Remodeling in Rat Model of Chronic Thromboembolic Pulmonary Hypertension. J Cardiovasc Dev Dis. 2023; 10(2):40. DOI: 10.3390/jcdd10020040.Kondratov K, Kurapeev D, Popov M, et al. Heparinase treatment of heparin-contaminated plasma from coronary artery bypass grafting patients enables reliable quantification of microRNAs. Biomol Detect Quantif. 2016; 8:9–14. DOI: 10.1016/j.bdq.2016.03.001.Kondratov K, Kurapeev D, Popov M, et al. Heparinase treatment of heparin-contaminated plasma from coronary artery bypass grafting patients enables reliable quantification of microRNAs. Biomol Detect Quantif. 2016; 8:9–14. DOI: 10.1016/j.bdq.2016.03.001.Gao P, Li C, Ning Y, et al. Improvement of surgical techniques for orthotopic single lung transplantation in rats. Ann Transl Med. 2022; 10(12):673. DOI: 10.21037/atm-22-2018.Gao P, Li C, Ning Y, et al. Improvement of surgical techniques for orthotopic single lung transplantation in rats. Ann Transl Med. 2022; 10(12):673. DOI: 10.21037/atm-22-2018.Lee LYY, Suryadinata R, McCafferty C, et al. Heparin Inhibits SARS-CoV-2 Replication in Human Nasal Epithelial Cells. Viruses. 2022 24; 14(12):2620. DOI: 10.3390/v14122620.Lee LYY, Suryadinata R, McCafferty C, et al. Heparin Inhibits SARS-CoV-2 Replication in Human Nasal Epithelial Cells. Viruses. 2022 24; 14(12):2620. DOI: 10.3390/v14122620.Alinezhad P, Staji H, Sani RN. Comparison of three methods including temperature, H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>/ascorbic acid/sonication, and nitrous acid treatments for overcoming the inhibitory effect of heparin on DNA amplification in realtime-PCR. Int J Biol Macromol. 2022; 209:1298–1306. DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2022.04.113.Alinezhad P, Staji H, Sani RN. Comparison of three methods including temperature, H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>/ascorbic acid/sonication, and nitrous acid treatments for overcoming the inhibitory effect of heparin on DNA amplification in realtime-PCR. Int J Biol Macromol. 2022; 209:1298–1306. DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2022.04.113.Sidstedt M, Rådström P, Hedman J. PCR inhibition in qPCR, dPCR and MPS-mechanisms and solutions. Anal Bioanal Chem. 2020; 412(9):2009–2023. DOI: 10.1007/s00216-020-02490-2Sidstedt M, Rådström P, Hedman J. PCR inhibition in qPCR, dPCR and MPS-mechanisms and solutions. Anal Bioanal Chem. 2020; 412(9):2009–2023. DOI: 10.1007/s00216-020-02490-2

The authors declare that there are no conflicts of interest present.