Юлия Александровна Власова, к. б. н., старший научный сотрудник
НИЛ молекулярного и клеточного моделирования и генной терапии
197341; ул. Аккуратова, д. 2; Санкт-Петербург
Yulia A. Vlasova, Cand. Sc. (Biology), Senior researcher
Research Laboratory of Molecular and Cellular Modeling and Gene Therapy
197341; Akkuratova str., 2; Saint Petersburg
Екатерина Сергеевна Клименко, младший научныйсотрудник
НИЛ молекулярного и клеточного моделирования и генной терапи
Санкт-Петербург
Ekaterina S. Klimenko, Junior Researcher
Research Laboratory of Molecular and Cellular Modeling and Gene Therapy
Saint Petersburg
Ксения Сергеевна Сухарева, PhD, младший научный сотрудник
НИЛ молекулярного и клеточного моделирования и генной терапии
Санкт-Петербург
Ksenia S. Sukhareva, PhD, Junior Researcher
Research Laboratory of Molecular and Cellular Modeling and Gene Therapy
Saint Petersburg
Лидия Сергеевна Гаврилова, магистрант
Институт медицинского образования
Санкт-Петербург
Lidiya S. Gavrilova, Master’s student
Institute of Medical Education
Saint Petersburg
Анна Александровна Костарева, д. м. н., директор Института, профессор
Институт молекулярной биологии и генетики; Институт медицинского образования; кафедра факультетской терапии с клиникой
Санкт-Петербург
Anna A. Kostareva, MD, PhD, Director of the Institute, Professor
Institute of Molecular Biology and Genetics; Institute of Medical Education; Department of Faculty Therapy with the Clinic
Saint Petersburg
В статье представлены результаты адаптации методики определения изменений митохондриального мембранного потенциала (MMP) в клетках С2С12 с использованием готового набора «Mitochondrial membrane Potential Kit» производства Sigma-Aldrich (каталожный номер MAK159) для исследования на микропланшетном ридере и флуоресцентном микроскопе. Подобраны условия для проведения измерения, необходимые разведения для получения оптимальной концентрации для измерения MMP в клетках мышиных миобластов С2С12. Проведено сравнение правильности выполнения исследования с использованием флуоресцентного красителя TMRE (этилового эфира тетраметилродамина).
Актуальность. При использовании готового набора «Mitochondrial membrane Potential Kit» (Sigma-Aldrich) мы столкнулись с тем, что в руководстве пользователя производитель не указывает концентрацию JC-10 и дает лишь общие рекомендации по использованию красителя, не учитывающие тип клеток, размер, плотность, разницу во времени инкубации для различных культур клеток.
Цель работы. Адаптировать методику определения МMП (митохондриальный мембранный потенциал) в клетках С2С12 с использованием набора для исследования на микропланшетном ридере и электронном микроскопе.
Материалы и методы. ММП в клетках С2С12 измерялся двумя методами: с помощью флуоресцентной микроскопии (Zeiss, программа Zen) и с использованием планшетного флуориметра (CLARIOstar (BMG LABTECH). В качестве флуоресцентных зондов использовались красители JC-10, TMRE (Sigma-Aldrich).
Результаты. Были подобраны оптимальные условия для регистрации изменения митохондриального мембранного потенциала в клетках С2С12. Достоверные и воспроизводимые результаты были получены при 100-кратном разведении раствора красителя для загрузки JC-10 (Dye Loading Solution) и замене стандартного буфера производителя на стандартный натрий-фосфатный буфер (рН = 7,4).
Заключение. При использовании готовых наборов для измерения ММП методика, предложенная производителем, может не подходить для выбранной клеточной линии. В нашем случае при исследовании мышиных миобластов линии С2С12 оптимальным оказалось разведение красителя для загрузки в 100 раз по сравнению с рекомендованным производителем.
Background. We used the “Mitochondrial Membrane Potential Kit” (Sigma-Aldrich) to detected MMP but encountered difficulties by applied this kit because in manual there not JC-10 concentration and it not allowing for account cell type, size, density, differences in incubation time for different cell cultures.
Objective. Adaptation of the method for determining MMP (mitochondrial membrane potential) in C2C12 cells using in microplate reader and electron microscope.
Design and methods. MMP in C2C12 cells was measured by two way, using fluorescence microscopy (Zeiss, Zen program) and using a plate fluorimeter (CLARIOstar (BMG LABTECH). JC-10 and TMRE dyes (Sigma-Aldrich) were used as fluorescent probes.
Results. Optimal conditions for detection changes in mitochondrial membrane potential in C2C12 cells were selected. 100- fold dilution of the dye JC-10 (Dye Loading Solution) and replacement of the manufactured buffer to PBS led to repeatability and reproducibility results.
Conclusion. When using ready-made kits for measuring MMP, the method proposed by the manufacturer may not be suitable for the selected cell line. In our study to mouse myoblasts of the C2C12 line, a dilution of the dye for loading was required 100 times compared to that recommended by the manufacturer.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.