transmedТрансляционная медицинаTranslational Medicine2311-44952410-5155Almazov National Medical Research Centre, Saint Petersburg, Russia10.18705/2311-4495-2022-9-6-59-70transmed-743Research ArticleЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯExperimental studiesПрямое сравнение вариантов дальне-красных флуоресцентных белков KATUSHKA с люциферазной биолюминесценцией на ксенографтных мышиных моделях изучения опухолей эпителиального происхожденияDirect comparison of KATUSHKA far-red fluorescent protein variants with luciferase bioluminescence in xenograft mouse models of epithelial tumor studieshttps://orcid.org/0000-0002-2883-2496ЛевчукК. А.LevchukK. A.

Левчук Ксения Александровна, аспирант, младший научный сотрудник 

ул. Аккуратова, д. 2, Санкт-Петербург, 197341

Ksenia A. Levchuk, PhD student, Junior researcher

Saint Petersburg

ksenialevchuk2@gmail.comБогдановаД. А.BogdanovaD. A.

Богданова Дарья Алексеевна, младший научный сотрудник, аспирант Научно-технологического университета «Сириус»; старший лаборант-исследователь

Санкт-Петербург

Сочи

Daria A. Bogdanova, Senior laboratory researcher; Junior researcher, PhD student

Saint Petersburg

Sochi

dasha351rus@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-5791-8360ЕршоваА. Е.ErshovaA.

Ершова Алина Евгеньевна, студент Научно-технологического университета «Сириус»; лаборант-исследователь 

Санкт-Петербург

Daria A. Bogdanova, Senior laboratory researcher; Junior researcher, PhD student

Saint Petersburg

Sochi

lina.ershova.99@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-6456-6295СмирновС. В.SmirnovS. V.

Смирнов Сергей Владимирович, младший научный сотрудник

Санкт-Петербург

Sergey V. Smirnov, Junior researcher

Saint Petersburg

Sergeiismirnoff@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-3456-4264ГолдаеваА. А.GoldaevaA. A.

Смирнов Сергей Владимирович, младший научный сотрудник

Санкт-Петербург

Alexandra A. Goldaeva, student

Saint Petersburg

alexandra33013@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-3295-8411ВасютинаМ. Л.VasuytinaM. L.

Васютина Марина Львовна, научный сотрудник, ветеринарный врач вивария 

Санкт-Петербург

Marina L. Vasyutina, Researcher, Vivarium veterinarian

Saint Petersburg

raluwow@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-2497-653XИстоминаМ. С.IstominaM. S.

Истомина Мария Сергеевна, младший научный сотрудник 

Санкт-Петербург

Maria S. Istomina, Junior researcher

Saint Petersburg

ist_mary@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0003-4323-7174ДемидовО. Н.DemidovO. N.

Демидов Олег Николаевич, д.м.н., ведущий научный сотрудник; ведущий научный сотрудник Научно-технологического университета «Сириус»

Санкт-Петербург

Сочи

Oleg N. Demidov, MD, Leading researcher; Leading researcher, Sirius University of Science and Technology

Saint Petersburg

Sochi

demidov.on@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-7298-5238ПетуховА. В.PetukhovA. V.

Петухов Алексей Вячеславович, научный сотрудник 

Санкт-Петербург

Alexey V. Petukhov, researcher

Saint Petersburg

alexeysakhalin@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0003-1629-7868ТороповаЯ. Г.ToropovaYa. G.

Торопова Яна Геннадьевна, к.б.н., доцент кафедры патологической физиологии лечебного факультета Института медицинского образования, заведующий НИЛ биопротезирования и кардиопротекции; заместитель директора по научной работе 

Санкт-Петербург

Yana G. Toropova, Ph.D., assistant professor, Department of pathological physiology, Institute of medical education, Head of the Bioprosthetics and Cardioprotection Research Laboratory; deputy director of scientific work

Saint Petersburg

yana.toropova@mail.ruФедеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр имени В. А. Алмазова» Министерства здравоохранения Российской ФедерацииAlmazov National Medical Research CentreФедеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт цитологии Российской академии наук»; Автономная некоммерческая образовательная организация высшего образования «Научно-технологический университет «Сириус»Institute of Cytology, Russian Academy of Science; Sirius University of Science and TechnologyФедеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр имени В. А. Алмазова» Министерства здравоохранения Российской ФедерацииAlmazov National Medical Research Centre; Sirius University of Science and TechnologyФедеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Санкт-Петербургский государственный университет»Institute of Experimental MedicineФедеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр имени В. А. Алмазова» Министерства здравоохранения Российской Федерации; Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт цитологии Российской академии наук»; Автономная некоммерческая образовательная организация высшего образования «Научно-технологический университет «Сириус»Almazov National Medical Research Centre; Institute of Cytology, Russian Academy of Science; Sirius University of Science and TechnologyФедеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр имени В. А. Алмазова» Министерства здравоохранения Российской Федерации; Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Институт экспериментальной медицины»Almazov National Medical Research Centre; Institute of Experimental Medicine202202032023965970Copyright © Левчук К.А., Богданова Д.А., Ершова А.Е., Смирнов С.В., Голдаева А.А., Васютина М.Л., Истомина М.С., Демидов О.Н., Петухов А.В., Торопова Я.Г., 20232023Левчук К.А., Богданова Д.А., Ершова А.Е., Смирнов С.В., Голдаева А.А., Васютина М.Л., Истомина М.С., Демидов О.Н., Петухов А.В., Торопова Я.Г.Levchuk K.A., Bogdanova D.A., Ershova A., Smirnov S.V., Goldaeva A.A., Vasuytina M.L., Istomina M.S., Demidov O.N., Petukhov A.V., Toropova Y.G.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://transmed.almazovcentre.ru/jour/article/view/743Актуальность

Актуальность. Исследования в области онкологии требуют использования животных ксенографтных моделей, соответствующих принципам гуманности и рациональности. Доклинические исследования низкомолекулярных ингибиторов, противоопухолевых моноклональных антител, вакцин, клеточных препаратов, в том числе CAR-T клеток, нуждаются в прижизненном контроле динамики роста опухоли. Широко применяемая люциферазная детекция биолюминесценции ксенографтов требует введения субстрата, однако инъекции менее гуманны, более трудоемки, дорогостоящи, стрессируют животное. Альтернативой люциферазной биолюминесценции могут быть флуоресцентные белки дальне-красного спектра, визуализация эмиссии которых в экспериментальных моделях in vivo упростит манипуляции с животными и увеличит доступность детекции.

Цель

Цель. Сравнить эффективность детекции динамики роста опухолевых ксенографтов in vivo в мышиных моделях с инъекцией опухоли шейки матки, применяя доступную линейку флуоресцентных дериватов красного белка одной клады Katushka с распространенной в in vivo исследованиях люциферазой Renilla.

Материалы и методы

Материалы и методы. Ксенографтные модели NSG-SGM3 мышей были получены подкожным введением модифицированных клеток линии HeLa, экспрессирующих флуоресцентные белки-репортеры Katushka, Katushka2S, TurboRFP, TurboFP650 и люциферазу Renilla. Исследование и оценку флуоресцентного и биолюминесцентного сигнала опухоли проводили на 7, 14, 21 сутки после введения ксенографта.

Результаты

Результаты. Спектральные характеристики и детекция эмиссии белков-репортеров Katushka и Katushka2S выделяют данные маркеры среди всей линейки исследуемых белков дальне-красного спектра.

Заключение

Заключение. Детекция флуоресцентного сигнала дальне-красных белков-репортеров Katushka и Katushka2S может служить полноценной альтернативой люциферазной биолюминесценции фермента Renilla в экспериментальных моделях in vivo в рамках иммунотерапевтических исследований.

Background

Background. Research in oncology assumes establishment and usage of xenograft animal models, meeting the requirements of humanity and rationality. Although praised as promising field of research, preclinical studies of low-molecular-weight inhibitors, antitumor monoclonal antibodies, vaccines, cellular therapy products, CAR-T cells entail continuous control of tumor growth dynamics. Luciferase detection of bioluminescence requires injection of a reporter substrate. However, injections not only are laborious, time-consuming and expensive, but are also stressful for animals. Thus, a vast variety of new visualization methods is employed, including proteins of the far-red spectrum.

Objective

Objective. The study aimed to compare detection efficiency of tumor growth dynamics in mice models of cervical cancer, applying a commercially available line of fluorescent red protein derivatives of Katushka clade and Renilla luciferase, that is commonly used in in vivo studies.

Design and methods

Design and methods. Xenograft mice models were derived injecting modified HeLa cell line, that expresses fluorescent reporter proteins: Katushka, Katushka2S, TurboRFP, TurboFP650 and Renilla enzyme.

Results

Results. Spectral properties and emission wavelength of far-red fluorescent protein Katushka and Katushka2S outlines these markers within RFP derivatives lineage as outstanding instrument for in vivo tumor visualization.

Conclusion

Conclusion. Detection of fluorescent far-red reporters Katushka and Katushka2S can be considered as a credible alternative to Renilla luciferase bioluminescence in experimental models in vivo on the part of immunotherapy research.

биолюминесценциявизуализация ксенографтов in vivoлюциферазная детекцияфлуоресцентные белкифлуоресценция в биомедицинских исследованияхbioluminescencefluorescence in biomedical researchfluorescent proteinsluciferase detectionvisualization of xenografts in vivoРабота выполнена за счет средств РНФ № 1974-20026 от 16 апреля 2019 г. «Исследование механизмов эффективности T-клеток с химерным антигенным рецептором (CAR-T) против клеточных и животных моделей солидных опухолей» 2019- 2022 гг.Recent work was funded by the Russian Science Foundation No. 19-74-20026 dated April 16, 2019 “Investigation of the effectiveness of T-cells with a chimeric antigen receptor (CAR-T) against cell and animal models of solid tumors” 2019-2022.ReferencesShaner NC, Campbell RE, Steinbach PA, et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol. 2004; 22(12):1567–1572. DOI: 10.1038/nbt1037.Shaner NC, Campbell RE, Steinbach PA, et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol. 2004; 22(12):1567–1572. DOI: 10.1038/nbt1037.Shaner NC, Patterson GH, Davidson MW. Advances in fluorescent protein technology. J Cell Sci. 2007; 120(Pt 24):4247–4260. DOI: 10.1242/jcs.005801.Shaner NC, Patterson GH, Davidson MW. Advances in fluorescent protein technology. J Cell Sci. 2007; 120(Pt 24):4247–4260. DOI: 10.1242/jcs.005801.Shaner NC, Lambert GG, Chammas A, et al. A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum. Nat Methods. 2013; 10(5):407– 409. DOI: 10.1038/nmeth.2413.Shaner NC, Lambert GG, Chammas A, et al. A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum. Nat Methods. 2013; 10(5):407– 409. DOI: 10.1038/nmeth.2413.Shaner NC. Fluorescent proteins for quantitative microscopy: important properties and practical evaluation. Methods Cell Biol. 2014; 123:95–111. DOI: 10.1016/B978-012-420138-5.00006-9.Shaner NC. Fluorescent proteins for quantitative microscopy: important properties and practical evaluation. Methods Cell Biol. 2014; 123:95–111. DOI: 10.1016/B978-012-420138-5.00006-9.Swaminathan S. GFP: the green revolution. Nat Cell Biol. 2009; 11(S1):S20–S20. DOI: 10.1038/ncb1953.Swaminathan S. GFP: the green revolution. Nat Cell Biol. 2009; 11(S1):S20–S20. DOI: 10.1038/ncb1953.Hastings JW. Biological diversity, chemical mechanisms, and the evolutionary origins of bioluminescent systems. J Mol Evol. 1983; 19(5):309–321. DOI: 10.1007/BF02101634.Hastings JW. Biological diversity, chemical mechanisms, and the evolutionary origins of bioluminescent systems. J Mol Evol. 1983; 19(5):309–321. DOI: 10.1007/BF02101634.Otto-Duessel M, Khankaldyyan V, GonzalezGomez I, et al. In vivo testing of Renilla luciferase substrate analogs in an orthotopic murine model of human glioblastoma. Mol Imaging. 2006; 5(2):57–64.Otto-Duessel M, Khankaldyyan V, GonzalezGomez I, et al. In vivo testing of Renilla luciferase substrate analogs in an orthotopic murine model of human glioblastoma. Mol Imaging. 2006; 5(2):57–64.Filonov GS, Piatkevich KD, Ting LM, et al. Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging. Nat Biotechnol. 2011; 29(8):757–761. DOI: 10.1038/nbt.1918.Filonov GS, Piatkevich KD, Ting LM, et al. Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging. Nat Biotechnol. 2011; 29(8):757–761. DOI: 10.1038/nbt.1918.Shcherbakova DM, Verkhusha VV. Near-infrared fluorescent proteins for multicolor in vivo imaging. Nat Methods. 2013; 10(8):751–754. DOI: 10.1038/nmeth.2521.Shcherbakova DM, Verkhusha VV. Near-infrared fluorescent proteins for multicolor in vivo imaging. Nat Methods. 2013; 10(8):751–754. DOI: 10.1038/nmeth.2521.Krumholz A, Shcherbakova DM, Xia J, et al. Multicontrast photoacoustic in vivo imaging using nearinfrared fluorescent proteins. Sci Rep. 2014; 4:3939. DOI: 10.1038/srep03939.Krumholz A, Shcherbakova DM, Xia J, et al. Multicontrast photoacoustic in vivo imaging using nearinfrared fluorescent proteins. Sci Rep. 2014; 4:3939. DOI: 10.1038/srep03939.Leblond F, Davis SC, Valdés PA, et al. Pre-clinical whole-body fluorescence imaging: Review of instruments, methods and applications. J Photochem Photobiol B. 2010; 98(1):77–94. DOI: 10.1016/j.jphotobiol.2009.11.007.Leblond F, Davis SC, Valdés PA, et al. Pre-clinical whole-body fluorescence imaging: Review of instruments, methods and applications. J Photochem Photobiol B. 2010; 98(1):77–94. DOI: 10.1016/j.jphotobiol.2009.11.007.Gurskaia NG, Staroverov DB, Fradkov AF, et al. Coding region of far-red fluorescent protein katushka contains a strong donor splice site. Bioorg Khim. 2011; 37(3):425–428. DOI: 10.1134/s1068162011030071.Gurskaia NG, Staroverov DB, Fradkov AF, et al. Coding region of far-red fluorescent protein katushka contains a strong donor splice site. Bioorg Khim. 2011; 37(3):425–428. DOI: 10.1134/s1068162011030071.Luker KE, Pata P, Shemiakina II, et al. Comparative study reveals better far-red fluorescent protein for whole body imaging. Sci Rep. 2015; 5:10332. DOI: 10.1038/srep10332.Luker KE, Pata P, Shemiakina II, et al. Comparative study reveals better far-red fluorescent protein for whole body imaging. Sci Rep. 2015; 5:10332. DOI: 10.1038/srep10332.Shcherbo D, Murphy CS, Ermakova GV, et al. Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues. Biochem J. 2009; 418(3):567–574. DOI: 10.1042/BJ20081949.Shcherbo D, Murphy CS, Ermakova GV, et al. Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues. Biochem J. 2009; 418(3):567–574. DOI: 10.1042/BJ20081949.Shcherbo D, Shemiakina II, Ryabova AV, et al. Near-infrared fluorescent proteins. Nat Methods. 2010; 7(10):827–829. DOI: 10.1038/nmeth.1501.Shcherbo D, Shemiakina II, Ryabova AV, et al. Near-infrared fluorescent proteins. Nat Methods. 2010; 7(10):827–829. DOI: 10.1038/nmeth.1501.FPbase: The Fluorescent Protein Database. https://www.fpbase.org/organism/6118/FPbase: The Fluorescent Protein Database. https://www.fpbase.org/organism/6118/The Jackson Laboratory. https://www.jax.org/strain/005557The Jackson Laboratory. https://www.jax.org/strain/005557Xia X, Li H, Satheesan S, Zhou J, et al. Humanized NOD/SCID/IL2rγnull (hu-NSG) Mouse Model for HIV Replication and Latency Studies. J Vis Exp. 2019; (143):10.3791/58255. DOI: 10.3791/58255.Xia X, Li H, Satheesan S, Zhou J, et al. Humanized NOD/SCID/IL2rγnull (hu-NSG) Mouse Model for HIV Replication and Latency Studies. J Vis Exp. 2019; (143):10.3791/58255. DOI: 10.3791/58255.Skoda J, Neradil J, Staniczkova Zambo I, et al. Serial Xenotransplantation in NSG Mice Promotes a Hybrid Epithelial/Mesenchymal Gene Expression Signature and Stemness in Rhabdomyosarcoma Cells. Cancers (Basel). 2020; 12(1):196. DOI: 10.3390/cancers12010196.Skoda J, Neradil J, Staniczkova Zambo I, et al. Serial Xenotransplantation in NSG Mice Promotes a Hybrid Epithelial/Mesenchymal Gene Expression Signature and Stemness in Rhabdomyosarcoma Cells. Cancers (Basel). 2020; 12(1):196. DOI: 10.3390/cancers12010196.Jurczyk A, Diiorio P, Brostowin D, et al. Improved function and proliferation of adult human beta cells engrafted in diabetic immunodeficient NOD-scid IL2rγ(null) mice treated with alogliptin. Diabetes Metab Syndr Obes. 2013; 6:493–499. DOI: 10.2147/DMSO.S53154.Jurczyk A, Diiorio P, Brostowin D, et al. Improved function and proliferation of adult human beta cells engrafted in diabetic immunodeficient NOD-scid IL2rγ(null) mice treated with alogliptin. Diabetes Metab Syndr Obes. 2013; 6:493–499. DOI: 10.2147/DMSO.S53154.Wen H, Qu Z, Yan Y, et al. Preclinical safety evaluation of chimeric antigen receptor-modified T cells against CD19 in NSG mice. Ann Transl Med. 2019; 7(23):735. DOI: 10.21037/atm.2019.12.03.Wen H, Qu Z, Yan Y, et al. Preclinical safety evaluation of chimeric antigen receptor-modified T cells against CD19 in NSG mice. Ann Transl Med. 2019; 7(23):735. DOI: 10.21037/atm.2019.12.03.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.